Atlas de histología vegetal y animal
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Ténicas histológicas

3. INCLUSIÓN

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Una vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su observación con el microscopio. Ello implica hacer secciones para teñirlas primero y posteriormente observarlas. Como regla general se procede al endurecimiento de la muestra para poder obtener dichas secciones ya que lo normal es que cuanto más delgada queramos una sección más consistente debe ser la muestra de la que se obtiene. Los tejidos se endurecen a consecuencia de la fijación, pero esta dureza no es muy alta e impide la obtención de cortes generalmente más delgados que 20 o 30 µm. Sólo en el caso de que queramos trabajar con secciones relativamente gruesas (entre 30 y 200 µm) se puede aprovechar el endurecimiento provocado por el fijador y obtener dichas secciones con el vibratomo. Este tipo de aparato se utiliza en ciertas técnicas donde es necesaria una buena preservación molecular. Sin embargo, en muchos casos necesitamos endurecer más el tejido para obtener secciones más finas, lo cual se puede hacer de dos formas: por congelación o por inclusión.

La congelación de los tejidos previamente fijados permite la obtención de secciones que pueden ir desde unas 50 µm hasta nm de grosor, para lo que se utilizan diferentes aparatos: microtomo de congelación para secciones de decenas de µm, criostato para secciones de entre 5 y 20 µm y ultracriotomo para secciones ultrafinas del orden de nm. Para evitar los daños que se producen durante los procesos de congelación, como la formación de cristales de hielo que nos agujerean los tejidos, se pueden usar: a) Anticongelantes que impidan la formación de cristales. El crioprotector más usado es la sacarosa al 30 %, aunque también se usa el dimetil sulfóxido, el glicerol, etilén glicol y otros. La elección de uno u otro depende del tipo de muestra y de la técnica que se vaya a usar. b) Una congelación lo más rápida posible, por ejemplo, con nitrógeno líquido. Cuanto más rápida es la congelación menores son las dimensiones de los cristales de agua formados.

Inclusión
Se pueden obtener secciones de grosor variable utilizando diferentes métodos. Secciones más finas se obtienen endureciendo más el tejido. Esto se puede conseguir mediante la congelación o embebiendo el tejido en sustancias que solidifican como la parafina o ciertas resinas. Téngase en cuenta que las dimensiones de los cortes y objetos que se muestran en este dibujo no están a escala. Una rejilla es mucho más pequeña que un portaobjetos. Las dimensiones en µm y nm se refieren al espesor de las secciones.

La inclusión es el método más común de endurecer el tejido y consiste en infiltrar la muestra con sustancias líquidas que tras un proceso de polimerización o enfriamiento se solidifican, sin afectar a las características del tejido. Con ello se consigue obtener cortes del orden de µm a nm, según el medio de inclusión, sin que el tejido se rompa o se deteriore. Además, son un buen método para preservar las muestras durante largos periodos de tiempo. Existen diferentes sustancias o medios de inclusión dependiendo del grosor del corte y de la técnica que necesitemos realizar. Cuando se quieren hacer secciones para su observación con el microscopio óptico los medios de inclusión más frecuentemente usados son la parafina o la celoidina, mientras que si vamos a realizar observaciones con el microscopio electrónico la inclusión se realiza con resinas, principalmente de tipo acríclicas o epoxy. La mayoría de estas sustancias no son hidrosolubles, es decir, no son miscibles con el agua, luego si queremos que la sustancia en la que vamos a incluir ocupe todo el tejido tenemos que eliminar el agua y sustituirla por un líquido miscible con dicha sustancia. Si una muestra no está completamente embebida en el medio de inclusión se deteriorará y la obtención de secciones homogéneas será imposible.


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Actualizado: 15-08-2014