Atlas de histología vegetal y animal
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Ténicas histológicas

5.TINCIONES GENERALES
« Tinción Histoquímica »

La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos teñirlos para observar sus características morfológicas. Las tinciones generales están basadas en el uso de colorantes, sustancias mediante las cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a afinidades químicas. Se utilizan normalmente para teñir a las células y componentes tisulares que van a ser observados con el microscopio óptico y por ello se realizan habitualmente sobre secciones de tejido, siendo las más utilizadas las secciones obtenidas a partir de inclusiones en parafina u obtenidas en el criostato. Los colorantes son los elementos principales de las tinciones generales. Son moléculas que poseen tres componentes importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromático de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominado cromóforo, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molécula se denomina cromógeno.

Según la naturaleza química del cromóforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinónicas, derivados de diferrilmetano y triferrilmetano, derviados del xanteno y derivados de las talocianinas.

Según la naturaleza química del radical auxocromo los colorantes se clasifican en:

Básicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte ácida es incolora. Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los glucosaminoglucanos. Así, ponen de manifiesto el núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy abundante, así como ciertas matrices extracelulares ricas en componentes ácidos. Ejemplos de colorantes básicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina

Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y también el colágeno de la matriz extracelular. Ejemplos de colorantes ácidos son la fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la eosina.

Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad para aportar color. Por tanto un mismo colorante puede teñir tanto las partes básicas como las ácidas de los tejidos. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.

Indiferentes: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante sudán se disuelve en los lípidos y por tanto teñirá a las gotas de lípidos, especialmente en los adipocitos.

En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos tisulares de manera específica y para ello usamos colorantes que tienen apetencia por dichas estructuras. Por ejemplo, la tinción denominada azán contiene azocarmín y anilina-naranja-ácido acético que tiñe los núcleos de rojo y sobre todo destaca el conectivo intensamente teñido de azul. Otra tinción combinada es el tricrómio de Mallory que tiñe el colágeno de verde, las células musculares de rojo.

Cuando un colorante se une al tejido y refleja un color diferente al que tiene en solución se dice que ha ocurrido un fenómeno de metacromasia. Esto se debe a que las propiedades de absorción de la luz del colorante cambian al unirse a componentes celulares. Por ejemplo, el azul de toluidina se vulve púrpura cuando se une a ciertos gránulos de los mastocitos. Cuando el colorante unido al tejido tiene el mismo color que en solución se denomina ortocromasia.

Tinción general. Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es la hematoxilina-eosina sobre cortes de parafina. Como vemos se usa un colorante básico y otro ácido para teñir de diferente color a las estructuras ácidas y básicas de la célula. Antes de proceder a la tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el desaparafinado, puesto que estos cortes son hidrosolubles. Si partimos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.

Riñón teñido con hetamoxilina-eosina
Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir de una inclusión en parafina y teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de color violáceo (hemtoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina).
Tinción con hematoxilina-eosina
Pasos que se siguen durante una tinción general de hematoxilina-eosina. Los tiempos son aproximativos porque dependen del grosor de los cortes y de la concentración de los colorantes. El desparafinado permite eliminar el medio de inclusión, la parafina. El paso por agua de grifo es típico de la hematoxilena y se denomina diferenciación. Las sales del agua permiten obtener una coloración más violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades ópticas excelentes. Además, conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el montado y secado (evaporación del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio óptico.

Tinción de semifinos. Cuando se procesa material para microscopía electrónica es necesario, a veces, hacerse una idea de qué zona del tejido vamos a cortar. Téngase en cuenta que el área de una sección para observar con el microscopio electrónico es muy pequeña. Además, el proceso de osmificación que ha de llevarse a cabo previamente a la inclusión acarrea el oscurecimiento del tejido, con lo que dificulta aún más la orientación de la muestra. Por ello es frecuente hacer secciones de 0.5 a 1 µm de grosor con el ultramicrotomo, para orientarnos en la muestra y seleccionar la zona a partir de la cual haremos las secciones ultrafinas. Los semifinos suelen tener áreas más más grandes que las que posteriormente vamos a usar para la obtención de las secciones ultrafinas. El colorante usado para teñir secciones semifinas es normalmente el azul de toluidina, el cual puede infiltrase en la resina calentada en un plancha y llegar hasta el tejido.

Sección semifina de riñón teñido con azul de toluidina
Sección semifina de un glomérulo de un riñón obtenida a partir de una inclusión en resina y teñida con azul de toluidina.
Tinción de semifinos
Proceso de tinción de una sección semifina. La porosidad de la resina, el calor y las propiedades del colorante (azul de tolouidina) hacen que se pueda teñr el tejido sin necesidad de eliminar previamente la resina .

Contraste de ultrafinos. El contraste no es estrictamente una tinción, puesto que no aporta color a la muestra, pero sí es un proceso para poder observar los componentes ultraestructurales de la célula, por ese motivo lo incluimos en este apartado. Aunque las secciones para microscopía electrónica se pueden observar directamente con el microscopio electrónico se suelen tratar previamente con metales pesados en un proceso denominado contraste, obteniendo así una imagen óptima de la ultraestructura celular. Téngase en cuenta que en la microscopía electrónica lo importante no es añadir sustancias coloreadas sino moléculas que puedan interferir con el camino de los electrones emitidos por el microscopio y que atraviesan la muestra. Los electrones que atraviesan la muestra inciden sobre una pantalla fosforescente que emitirá destellos de luz cuando reciban el impacto de un electrón y permite observar las características del tejido. Los metales pesados unidos al tejido impedirán que pasen los electrones y por tanto se verá una zona negra en la pantalla fosforescente, mientras que en aquellas zonas de la célula donde no estén estos metales provocaraán áreas luminosas en dicha pantalla. Por ello todas las imágenes originales de microscopía electrónica son en blanco y negro, aunque se puedan colorear posteriormente con un ordenador.

Contraste de secciones ultrafinas
Proceso de contraste de secciones semifinas. Los tiempos de incubación en citrato de plomo y acetato de uranilo son aproximativos. Las lentejas de hidróxido sódico eliminan humedad del aire y dificultan la pricipitación del citrato de plomo. Los lavados en agua se llevan a cabo sumergiendo repetidas veces (en inglés, "deeping") la rejilla en el agua durante un tiempo de aproximadamente 30 segundos en cada pocillo con agua destilada.
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Actualizado: 2009-10-27